Cẩm nang bệnh cây – P14: Những phụ lục

P1 | P2 | P3 | P4 | P5 | P6 | P7 | P8 | P9 | P10 | P11 | P12 | P13 | P14

Phụ lục 1: Kỹ thuật làm một que cấy dẹp

Que cấy dẹp là một trong các vật dụng quan trọng nhất trong khu vực phòng thí nghiệm. Một que NiChrome (Nickel và Chromium Alloy, 80:20) đường kính 1 milimét, thường sử dụng để tạo nóng trong máy sấy tóc, là nguyên vật liệu phù hợp nhất (Hình A1/1).

1/ Cắt một đoạn dài 60 milimét.

2/ Đập dẹp một đầu que tới khoảng 3 lần bề ngang của que lúc đầu..

3/ Sử dụng kìm hoặc kéo nặng cắt gọn phần que dẹp thành đầu nhọn.

4/ Mài gọn phần đập dẹp.

5/ Gắn que vào cán.

6/ Hoàn tất que cấy dẹp.

Hình A1/1 Chia sẻ cách từng bước làm que cấy dẹp

Phụ lục 2: Sức khỏe và an toàn

Trên ruộng đồng

• Tuân theo nghiêm ngặt toàn bộ những quy định về an toàn khi dùng thuốc trừ dịch hại, nhất là thuốc trừ sâu. Chỉ sử dụng những hóa chất đã được đăng ký.
• Rửa tay cẩn trọng trước khi ăn, nhất là sau những công việc có dính đất.
• Uống đủ nước vào các ngày nóng bức trên ruộng đồng.
• Cẩn trọng với dao rựa để giúp tránh cắt phạm vào chính mình hay người khác.

Trong khu vực phòng thí nghiệm

• Kiểm tra những chỉ dẫn an toàn của toàn bộ những hóa chất trước khi sử dụng. Có thể phát hiện thấy những thông tin đó trên bao bì sản phẩm hoặc từ mạng internet. Những công ty hóa chất lớn cung ứng những nối kết với Dữ liệu An toàn Nguyên vật liệu tương ứng với sản phẩm của họ.
• Sử dụng găng tay khi cần.
• Cồn êtyl cực kỳ dễ bắt lửa. Đừng lau bàn bằng cồn ở vị trí gần ngọn lửa.
• Giữ một chăn chống lửa trong khu vực phòng thí nghiệm để dập tắt cháy quần áo.
• Mang giày trong khu vực phòng thí nghiệm để bảo vệ tránh vật nhọn rơi lên chân. Giày kín cũng bảo vệ chân tránh thủy tinh vỡ và hóa chất.
• Không mở nồi hấp trước khi áp suất trong nồi trở lại bình thường (khi đồng hồ chỉ số 0). Luôn sử dụng găng tay dày khi lấy bất kể nguyên vật liệu gì từ nồi hấp hoặc tủ sấy.
• Cẩn trọng khi mở tủ sấy. Nhiệt độ cao và hơi nước nóng có thể gây bỏng trầm trọng.

Phụ lục 3: Môi trường, tiệt trùng và bảo quản mẫu vi sinh vật

Phần môi trường bao gồm những công thức cho một vài môi trường thông thường.. Có rất nhiều loại môi trường đã được sinh ra cho một vài loài nấm hoặc quy trình thí nghiệm cụ thể. Các loại môi trường này được miêu tả trong những tài liệu khoa học, nhất là trong những bài báo đăng những tạp chí khoa học.

Điều đặc biệt là hiểu những quy tắc cơ bản trong việc tiệt trùng môi trường, vật dụng thủy tinh và thiết bị khác bằng nhiệt. Thông thường thời gian xử lý cần phải được điều chỉnh cho thích hợp với số lượng và tính chất của nguyên vật liệu được tiệt trùng. Thông thường thời gian xử lý cũng khác nhau đáng kể giữa biện pháp tiệt trùng nóng ẩm (sử dụng nồi hấp) và nóng khô (sử dụng tủ sấy).

Có rất nhiều cách bảo quản để lưu giữ mẫu nuôi cấy nấm. Một vài biện pháp thông thường hay được trình bày trong phần này và nhiều biện pháp khác đã được nêu trong những tài liệu khác.

Có rất nhiều loại môi trường đã được sinh ra để nuôi cấy nấm. Trong số đó, có rất nhiều môi trường phù hợp cho việc nuôi cấy tất cả các loại nấm như môi trường thạch nước cất (WA), môi trường thạch đường khoai tây (PDA). Những môi trường khác, như môi trường lựa chọn nbsp;Phytophthora (PSM) và agar pentachloronitrobenzene peptone (PPA) là các môi trường lựa chọn sử dụng để phân lập một vài nấm ổn định từ cây hoặc đất.

Môi trường tổng hợp, được làm hoàn toàn từ những hợp chất hóa học, có tính đồng nhất do kết cấu hóa học của chúng là chuẩn. Những môi trường tự nhiên, như PDA

hoặc thạch cà rốtkhoai tây (PCA), rẻ tiền và tạo cơ hội cho nấm sinh trưởng tốt. Tuy vậy, những môi trường tự nhiên (làm từ nguyên vật liệu tự nhiên, thường là những chất chiết thực vật) thay đổi dựa theo chất chiết từ cây. Nếu sử dụng môi trường tự nhiên để phân biệt đặc tính hình thức biểu hiện ra bên ngoài hoặc tỷ lệ phát triển thì hãy sử dụng cùng một mẻ môi trường cho toàn bộ những mẫu cấy. Một vài môi trường tự nhiên như PDA có hàm lượng hyđrat-cacbon cao, khiến cho sợi nấm khí sinh mọc nhanh. Nếu tiếp tục lặp lại việc cấy truyền trên các loại môi trường như vậy có khả năng làm cho nấm nhanh bị thoái hóa và mất độc tính. Do đó, nên sử dụng môi trường dinh dưỡng thấp để duy trì việc nuôi cấy.

---

 Trong khi tiệt trùng môi trường, nhớ nới lỏng nắp chai và vặn chặt sau khi đã tiệt trùng xong. Điều này tránh chai bị nổ trong hoàn cảnh áp suất cao và tránh phải tốn không ít công lau chùi.

---

Nên sử dụng đĩa Petri thủy tinh trong các phòng thí nghiệm chẩn đoán nhỏ tại những khu vực nhiệt đới. Kinh nghiệm cho biết môi trường trong đĩa Petri thủy tinh sẽ ít bị lây nhiễm tạp bởi những bào tử từ không khí hơn so sánh với môi trường trong đĩa nhựa.

A3/1/ Một vài đánh giá về thành phần môi trường

Nước

Nước máy thích hợp cho tất cả các loại môi trường, chính vì nước máy chứa những chất vi lượng thường không có trong nước cất. Tuy vậy, ở một vài vùng nước máy có thể có chứa độc tố đối với nấm. Một trong các chất đó là đồng có thể ức chế đối với rất đa số loài nấm. Trong các trường hợp này tốt hơn hết là nên sử dụng nước cất.

Agar

Agar là chất chiết xuất từ tảo, và chất lượng thay đổi phụ thuộc vào nguồn gốc. Agar có thể ở dạng bột, dạng thỏi hoặc dạng lớp. Nhiều agar bột dễ hòa tan trong khi hấp; những công thức nấu môi trường dưới đây đều dùng loại agar này.

Sử dụng loại agar chất lượng cao để môi trường, ví dụ môi trường thạch nước cất (WA), được trong. Môi trường WA sử dụng cho việc phân lập, cấy đơn bào tử, cấy đỉnh sinh trưởng sợi nấm và giám định cần phải trong suốt để có thể để ý được sợi nấm và bào tử dưới kính lúp soi nổi.

---

Chỉ sử dụng agar chất lượng thấp cho những môi trường không đòi hỏi sự trong suốt, như PDA và PCA. Tuy vậy nếu có thể tối ưu nhất đừng nên sử dụng agar chất lượng thấp.

---

Thạch nước cất là môi trường phân lập đa năng hữu hiệu nhất. Không sử dụng PDA để phân lập nấm từ những bộ phận cây. Chỉ sử dụng PDA để nuôi cấy cho việc xác định đặc tính hình thức biểu hiện ra bên ngoài tản nấm và sự tạo thành sắc tố. Sử dụng những môi trường khác để kích thích việc sinh sản và tạo thành bào tử, như mẩu lá hoặc thân, hoặc quả đậu khử trùng trong môi trường thạch nước cất. Những môi trường lựa chọn cực kỳ hữu ích cho việc phân lập nấm từ rễ hoặc mô bệnh nặng bị tạp nấm hoại sinh và vi khuẩn.

Chất kháng sinh

Chất kháng sinh có thể được cho vào môi trường phân lập nấm để hạn chế sự phát triển của vi khuẩn hoặc nấm không cấp thiết (Bảng A3/1). Đa số những chất kháng sinh (ngoại trừ chloramphenicol; xem phía dưới ) đều không bền nếu đun nóng vậy nên chỉ cho chất kháng sinh vào môi trường sau khi hấp tiệt trùng. Các chất kháng sinh này được hòa tan trong một lượng nhỏ nước cất sạch, dựa theo công thức. Đối với đa số những mục đích, chất kháng sinh có thể được thêm trực tiếp vào môi trường, nhưng đối với những thí nghiệm quan trọng, dung dịch kháng sinh cần phải được lọc khử trùng trước khi sử dụng.

Bảng A3/1/ Những chất kháng sinh thông dụng

Chất kháng sinh	Công dụng kháng	Tính hòa tan
Penicillins	Vi khuẩn Gram dương	Tan trong nước
Streptomycin	Vi khuẩn Gram âm	Tan trong nước
Neomycin	Vi khuẩn Gram dương	Tan trong nước
Chloramphenicol	Vi khuẩn Gram dương và âm	Tan trong Ethanol

Chloramphenicol có thể thêm vào môi trường trước khi tiệt trùng. Chloramphenicol bị nghi gây ung thư, vậy nên cũng như toàn bộ những chất kháng sinh khác cần lưu ý khi dùng.

Thuốc trừ nấm thường hay được sử dụng trong môi trường lựa chọn. Ví dụ loại nấm Fusarium có tính chịu tương đối với pentachloronitrobenzene (PCNB; Terrachlor® hoặc Quintozene) và dichloronitroaniline (DCNA; Allisan®) và các thuốc trừ nấm này được thêm vào môi trường lựa chọn cho Fusarium.

Rose Bengal được thêm vào một vài môi trường sử dụng để phân lập nấm từ đất. Chất này ngăn không cho việc phát triển của hầu hết các loại nấm, và được thêm vào môi trường để ức chế những loài nấm mọc nhanh tràn lên những tản nấm của những loài nấm mọc chậm. Tính độc của Rose Bengal được đẩy mạnh khi tiếp xúc với ánh sáng. Những đĩa môi trường Rose Bengal cần phải được cất giữ và ủ trong hoàn cảnh bóng tối.

---

 Khi thêm vào môi trường, cần hòa tan hoàn toàn lượng chất kháng sinh này trong 10 mililít nước khử trùng nhằm bảo đảm chất kháng sinh được phân bổ đều trong môi trường. Khi cho vào môi trường (ở 55°C) chất kháng sinh cần phải được trộn vào môi trường bằng phương pháp lắc cẩn trọng để giúp tránh sinh ra quá nhiều bọt.

---

Thường thì có rất nhiều loại môi trường khác nhau được sử dụng trong khu vực phòng thí nghiệm ở cùng một thời gian. Vậy nên, cách tốt nhất là nên sử dụng bút mực màu không phai có màu sắc khác nhau đánh dấu ở thành đĩa Petri để dễ dàng nhận biết các loại môi trường khác nhau. Nên có 1 cách đánh dấu cố định cho từng loại môi trường khác nhau và dán trên tường phòng thí nghiệm để giúp tránh nhầm lẫn.

A3/2/ Những môi trường tổng quát cho nấm

Thạch nước cất (WA)

WA (2%) gồm 20g agar trong 1 L nước và được sử dụng làm giá thể cho bào tử nảy mầm trước khi cấy đơn bào tử. Sợi nấm mọc thưa thớt trên môi trường này do đó cực kỳ phù hợp làm môi trường nền cho việc cấy đỉnh sinh trưởng của sợi nấm để nuôi cấy những tản nấm mới. Việc nấm mọc thưa trên WA cũng thuận lợi cho việc phân lập nấm từ những bộ phận của cây, nhất là rễ.

Để cấy đơn bào tử và cấy đỉnh sinh trưởng của sợi nấm, nên đổ môi trường ra đĩa khi còn tương đối nóng nhằm khiến cho môi trường được giàn mỏng trong đĩa – điều này hạn chế sự phát triển của nấm và hỗ trợ cho việc cắt bào tử hoặc đỉnh sợi nấm được dễ dàng hơn.

WA (0,05%), 0,5 g agar trong 1 L nước, sử dụng để chuẩn bị chuỗi pha loãng đất. Một lượng nhỏ agar làm chậm dần quá trình lắng của những phần tử nấm. Agar được hòa tan trong nước trước khi được chia sang những chai McCartney. Nắp chai được nới lỏng trong khi tiệt trùng và đóng chặt sau khi hoàn tất tiệt trùng.

Thạch lá cẩm chướng (CLA) hoặc thạch với những giá thể thực vật tự nhiên khác

CLA là môi trường giá thể tự nhiên (Fisher et al. 1982) được chuẩn bị bằng phương pháp để những miếng lá cẩm chướng khử trùng (khoảng 1 mẩu cho mỗi 2 mililít thạch) trong một đĩa Petri và tiếp đến đổ WA 2% đã khử trùng vào.

Những miếng lá cẩm chướng được chuẩn bị từ lá tươi không có dư lượng thuốc trừ nấm hoặc thuốc trừ sâu. Ngay sau khi thu thập, lá được cắt thành các mẩu dài 5-8 mm và sấy khô trong tủ sấy có thông gió ở khoảng 70°C trong 3-4 giờ cho đến lúc lá giòn. Có khả năng làm khô trong lò vi sóng. Các miếng lá khô được gói trong giấy nhôm hoặc hộp nhựa polycarbonate và tiệt trùng bằng phóng xạ gamma (25 kilograys). Những miếng lá đã được tiệt trùng có thể dự trữ ở 2-5°C tới 12 tháng trước khi sử dụng.

Đa số loài nấm sinh bào tử trên môi trường CLA trong vòng 6 đến 10 ngày. Ở trên môi trường này, hình thức biểu hiện ra bên ngoài bào tử vô tính đồng nhất hơn so sánh với khi sử dụng môi trường nhiều hydrat cacbon như PDA. Bào tử lớn của Fusarium hình thành từng khối trên những mẩu lá. Nên dùng bào tử lớn tạo thành trong những khối bào tử này cho việc giám định, vì chúng có hình dáng và chiều dài ổn định hơn so sánh với bào tử lớn tạo thành đơn độc từ cành bào tử phân sinh trên sợi nấm trong môi trường thạch. Bào tử nhỏ thường tạo thành đa phần trên sợi nấm mọc phía trên mặt thạch, cách xa những mẩu lá. Phương thức tạo thành những bào tử nhỏ, sự có mặt những chuỗi bào tử nhỏ, và bào tử hậu có thể được xác định bằng phương pháp kiểm tra trực tiếp trên kính hiển vi khi đĩa CLA nhỏ (đường kính 5 centimét ) được sử dụng cho việc giám định những mẫu nấm Fusarium. CLA cũng phù hợp cho việc sản sinh số lượng lớn bào tử cho những thí nghiệm.

---

 Nhiều bộ phận khác nhau của cây như những mẩu thân lúa xanh và quả đậu có thể thay thế cho lá cẩm chướng. Nếu cần thì tiệt trùng các mẩu cây này bằng nồi hấp. Bạn nên làm thí nghiệm để tìm ra loại nguyên vật liệu nào phù hợp nhất cho phòng thí nghiệm của bạn.

---

Thạch đường khoai tây (PDA)

PDA là môi trường nhiều hyđrat cacbon chứa 20 g dextrose, 20 g agar và nước luộc 250 g khoai tây trắng, trong 1 lít nước. Khoai tây không gọt vỏ nhưng rửa sạch và cắt viên trước khi nấu cho vừa mềm. Khoai tây luộc chín được lọc qua vải thưa sao cho có một chút bã khoai tây trong nước luộc.

Bào tử vô tính tạo thành trên PDA thường có hình dáng và kích cỡ không ổn định, và do đó ít được dùng trong việc giám định. Tuy vậy, hình thức biểu hiện ra bên ngoài tản nấm, sự tạo thành sắc tố và mức độ phát triển của đa số loài nấm trên PDA tương đối ổn định, miễn là môi trường được chuẩn bị cẩn trọng và mẫu vi sinh vật được nuôi cấy từ nguồn chuẩn và nuôi trong các điều kiện chuẩn. Đặc tính của những tản được dùng như một đặc tính phân loại thứ cấp. Cho dù môi trường PDA được sử dụng để phân lập một vài loài nấm bệnh, nhưng có rất nhiều loại nấm hoại sinh và vi khuẩn cũng phát triển nhanh trên PDA và có thể ức chế sự phát triển của nguyên nhân tạo bệnh. Đừng nên sử dụng môi trường PDA cho việc phân lập, đặc biệt không sử dụng PDA để phân lập nguồn gây bệnh từ rễ.

Nên sử dụng PDA một phần tư độ mạnh cho những mục đích phân lập, có bổ sung kháng sinh khi phân lập từ mô thân hoặc lá.

Spezieller Nährstoffarmer Agar (SNA)

SNA là môi trường thạch nghèo dinh dưỡng, có thể sủ dụng trong việc giám định và bảo quản những nguồn nấm Fusarium và Cylindrocarpon (Nirenberg 1976). Ngoài những việc giúp hạn chế sự thoái hóa của mẫu nấm, môi trường này thúc đẩy sự tạo thành bào tử nhỏ đồng đều. SNA được chuẩn bị bằng phương pháp hấp tiệt trùng, trong 1L nước cất:

Agar	20 g
KH2PO4	1 g
KNO3	1 g
MgSO4.7H2O	0.5 g
KCl	0.5 g
Glucose	0.2 g
Sucrose	0.2 g

Đặt 2 mẩu giấy lọc đã tiệt trùng (1 centimét vuông) lên phía phía trên mặt thạch sau khi đông, giúp thúc đẩy việc tạo thành bào tử.

Vì SNA trong suốt, nên có thể dễ dàng để ý mẫu nuôi cấy trực tiếp dưới kính hiển vi hoặc có thể đặt một mẫu nhỏ môi trường chứa nấm vào trên lam kính, nhỏ một giọt nước, đậy lamen lại và để ý dưới kính hiển vi. Môi trường SNA lỏng (không có agar) được sử dụng để nuôi cấy sinh khối sợi nấm cho việc tách DNA.

Thạch cà rốt khoai tây (PCA)

Cà rốt nghiền nhừ	20 g
Khoai tây nghiền nhừ	20 g (khoai tây gọt vỏ)
Agar	20 g

Gọt vỏ và cắt khoai tây, cà rốt thành các mẩu nhỏ. Bỏ vào trong một cốc đong có khoảng 200 mililít nước cất và đun sôi nhỏ lửa trong nửa tiếng. Tiếp đến nghiền hai thứ qua 1 rây mịn hoặc xay nhuyễn. Thêm agar và nước cất cho đủ 1L. Lắc đều rồi hấp. Khi đổ môi trường nên lắc liên tục để cho cà rốt/khoai tây được trộn đều trong môi trường.

Cà rốt nhuyễn có rất nhiều sterol, cấp thiết cho việc tạo thành thể cái ở những loài nấm trứng. PCA là một môi trường quan trọng kích thích việc tạo thành thể cái ở Pythium và Phytophthora.

A3/3/ Môi trường lựa chọn nấm

Môi trường lựa chọn nbsp;Phytophthora (PSM)

Công thức này có cả penicillin và lúc đầu đã được TS. Nguyễn Vĩnh Trường gợi ý những tác giả sử dụng ở Việt Nam.

Agar	8 g
Cà rốt nghiền nhuyễn	20 mililít (công thức phía dưới )
Khoai tây nghiền nhuyễn	80 mililít (công thức phía dưới )

Đổ đầy thành 1 L bằng nước cất, hấp và khi nguội xuống 55°C, thêm:

Hymexazol	3/7 mililít dung dịch trong nước:
Pimaricin	400 µL
Penicillin	200 mg

Bọc những đĩa môi trường bằng giấy nylon và cất trong tủ lạnh tránh tiếp xúc với ánh sáng. Loại bỏ môi trường sau một tháng. Đối với môi trường lựa chọn cho cả Phytophthora và Pythium, không dùng Hymexazol.

Cà rốt nghiền nhuyễn

Rửa, cắt viên 400 g cà rốt và hấp 10 phút trong 400 mililít nước cất. Nghiền nhuyễn rồi thêm 500 mililít nước. Có thể chia nhỏ ra trong hộp nhựa và để ngăn đá đến khi cần sử dụng.

Khoai tây nghiền nhuyễn

Cắt viên 200 g khoai tây và đun trong 500 mililít nước máy cho đến lúc mềm. Nghiền nhuyễn và thêm nước cho đủ 800 mililít. Cất giữ như trên.

Dung dịch mẹ Hymexazol

Cho 0,3 g hymexazol nguyên chất vào 20 mililít nước khử trùng.

Pimaricin

Pimaricin có thể được trực tiếp thêm vào agar lỏng. Lắc đều trước khi sử dụng. Gói bằng giấy nhôm và dự trữ trong tủ lạnh.

Peptone PCNB Agar (PPA / môi trường Nash-Snyder)

PPA gồm có môi trường nền cộng thêm chất kháng sinh và thuốc trừ nấm, có thể sủ dụng để phân lập lựa chọn những loài Fusarium từ đất pha loãng (Nash và Snyder 1962) hoặc từ những bộ phận cây. Môi trường này có thể ức chế đa số vi khuẩn và những loài nấm khác nhưng cho phép Fusarium mọc chậm, hình thành những tản nấm nhỏ đường kính 5-10 mm sau 5-7 ngày.

Môi trường nền trong 1 L nước:

Agar	20 g
Peptone	15 g
KH2PO4	1 g
MgSO4/7H20	0,5 g
Terrachlor®	1 g (có chứa PCNB 75% w/w)

Hấp môi trường nền và để nguội xuống 55oC trước khi thêm vào 10 mililít nước vô trùng có chứa:

Những đĩa môi trường đã được chuẩn bị cần phải được ‘để khô’ trong chỗ tối và mát trước khi sử dụng sao cho phần nước trong dung dịch đất được thấm nhanh. Đa số những loài Fusarium không tạo thành những tản nấm đặc biệt trên PPA; việc tạo thành bào tử kém và hình thức biểu hiện ra bên ngoài bào tử vô tính không giống thông thường. Những tản nấm phải được cấy truyền và làm thuần cho việc giám định. Đừng nên duy trì mẫu Fusarium trên PPA chính vì sự chuyển hóa của peptone dẫn tới việc tích tụ chất ammoniac độc.

PDA một phần tư độ mạnh có bổ sung kháng sinh.

Môi trường này được thiết kế đa số là để phân lập những loài Fusarium từ mô cây, như thân cây bị lây nhiễm nấm F. oxysporum gây héo. Môi trường này cũng có thể được sử dụng cho một loạt những nguyên nhân khác, nhưng nên thử trước khi sử dụng cho một thí nghiệm quan trọng. PDA là một môi trường hữu ích trong việc nghiên cứu chẩn đoán.

---

Không sử dụng môi trường này để phân lập Fusarium hoặc những loài nấm khác từ đất. 

---

Trong 1 L nước, trộn:

Chất chiết từ khoai tây	Nước lọc từ 62,5 g khoai tây nấu
Agar	20 g
Dextrose	5 g
PCNB (Terrachlor®)	0.,1 g

Hấp môi trường nền và để nguội xuống 55°C trước khi thêm, trong 10 mililít nước sạch:

Streptomycin sulfate	0,16 g
Neomycin sulfate	0,06 g

Dichloran chloramphenicol peptone agar (DCPA)

DCPA được sử dụng cho việc phân lập lựa chọn những loài Fusarium và dematiaceous hyphomycetes từ hạt ngũ cốc (Andrews và Pitt 1986). Môi trường nền, trong 1 L nước cất, có chứa:

Agar	20 g
Peptone	15 g
K2HPO4	1 g
MgSO4/7H2O	0,5 g
Chloramphenicol	0,2 g (chất kháng sinh phổ rộng – có thể hấp)

Sau khi hấp, thêm, trong 10 mililít ethanol:

Dichloran

0,002 g

Đừng nên sử dụng DCPA làm môi trường duy trì nấm chính vì sự chuyển hóa của peptone dẫn tới việc tích tụ amoniac tới mức độ độc. Dichloran ngăn không cho sự phát triển của nấm mucoraceous, và việc thiếu hụt nguồn hyđrat cacbon trong môi trường cản trở sự phát triển của Aspergillus và Penicillium.

Môi trường lá lúa (hoặc lá cỏ) cho Pythium

Môi trường này hữu dụng cho việc kích thích và để ý sự tạo thành bọc bào tử và thể cái ở đa số loài nbsp;Pythium. Bọc bào tử và thể cái tạo thành từ sợi nấm mọc phía trên mặt nước gần những miếng lá. Môi trường này có thể được chuẩn bị bằng phương pháp thả nổi những miếng lá lúa hay cỏ đã khử trùng trong đĩa Petri có nước:

1/ Cắt lá lúa thành các mẩu dài 3 centimét.

2/ Hấp và đặt 4-5 mẩu trong đĩa Petri lớn có chứa 15 mililít nước đã tiệt trùng.

3/ Cấy một mẩu thạch có chứa nguồn nấm vào môi trường.

Nấm sẽ phát triển trên những miếng lá, và sợi nấm sẽ mọc phía trên mặt nước. Để cố định nấm cho việc để ý bằng kính hiển vi:

1/ Đặt một miếng lamen dưới mặt nước.

2/ Cẩn trọng tách một chút sợi nấm và kéo lên phía trên lamen.

3/ Lấy lamen ra khỏi môi trường, lật sấp, và đặt lên phía trên một lam kính có nhỏ sẵn một giọt nước.

A3/4/ Môi trường sử dụng cho vi khuẩn

Môi trường King’s B (KBM)

Agar	15 g
Proteose peptone số 3	20 g
Glycerol, C.P.	10 mililít
K2HPO4	1,5 g
MgSO4	1,5 g
Nước cất	1L

Trộn chung toàn bộ những thành phần ngoại trừ MgSO4/ Chỉnh độ pH tới 7,2± 0,2/ Dần dần thêm MgSO4 và lắc đều. Hấp và đổ vào đĩa Petri 90 milimét.

Sucrose peptone agar (SPA)

Đường Sucrose	20 g
Peptone	5 g
K2HPO4	0,5 g
MgSO4/7H2O	0,25 g
Agar	20 g
Nước cất	1 L

Trộn chung toàn bộ những thành phần. Chỉnh độ pH tới 7,2± 0,2/ Hấp và đổ vào đĩa Petri 90 milimét.

Môi trường Tetrazolium

Môi trường này (Kelman 1954) có thể được sử dụng để phân biệt giữa những tản nấm của loài Ralstonia solanacearum đột biến và nguyên chủng. Dạng đột biến thường tạo thành những khuẩn lạc đỏ đậm, tròn với viền hẹp màu hơi xanh. Khuẩn lạc loại nguyên chủng có hình tròn khác thường, màu trắng, trông như dạng lỏng với trung tâm màu hồng.

Peptone	10 g
Casein hydrolysate	1 g
Glucose	5 g
Agar	17 g
Triphenyl tetrazolium chloride	0,05 g
Nước cất	1 L

Trộn chung toàn bộ những thành phần. Hấp và đổ vào đĩa Petri 90 milimét.

A3/5/ Tiệt trùng

Tiệt trùng là quá trình diệt trừ toàn bộ những vi sinh vật trong môi trường nuôi cấy hoặc trên bề mặt vật dụng thủy tinh sử dụng trong những công việc cần vô trùng, như những đĩa Petri thủy tinh.

Tiệt trùng bằng nhiệt

Nhiệt độ và thời gian cấp thiết để diệt trừ vi sinh vật tỷ lệ nghịch cùng nhau. Bảng A3/2 cho biết thời gian ít nhất cần cho tiệt trùng hiệu quả ở những mức nhiệt độ cho cả hai loại nóng ẩm và nóng khô:

Bảng A3/2/ Thông thường thời gian cần cho việc tiệt trùng nóng ẩm và nóng khô ở những mức nhiệt độ khác nhau

Nhiệt độ	Nóng ẩm	Nóng khô
100 °C	20 giờ
110 °C	2,5 giờ
121 °C	15 phút	8,0 giờ
130 °C	2,5 phút
140 °C		2,5 giờ

Các thời điểm này không đảm bảo khử trùng hoàn toàn. Đó là các mức thời gian được tính toán căn cứ vào kinh nghiệm và mức độ lẫn tạp bình thường của những vi sinh vật chịu nhiệt.

Loài, chủng và khả năng tạo thành bào tử của vi sinh vật tác động rất rộng lớn đến tính mẫn cảm của vi sinh vật đối với nhiệt. Trong hoàn cảnh tiệt trùng bằng nồi hấp, những dạng sinh trưởng sinh dưỡng của tất cả các loại vi khuẩn, nấm men, nấm và đa số những virút tạo bệnh động vật bị diệt trừ trong khoảng nhiệt độ từ 50oC đến 60oC trong 10 phút. Tuy vậy những bào tử vi khuẩn cần 15 phút ở nhiệt độ từ 100°C đến 121°C. Trong môi trường nóng khô những bào tử vi khuẩn cần 1 giờ ở 160°C.

Tính chất của nguyên vật liệu trong đó vi sinh vật được tiệt trùng bằng nhiệt cũng là một nhân tố quan trọng. Hàm lượng những chất hữu cơ cao thường có xu hướng bảo vệ bào tử và những vi sinh vật sinh dưỡng chống lại ảnh hưởng của nhiệt độ. Chất đạm, gelatin, đường, tinh bột, axít nuclêic, mỡ và dầu đều ảnh hưởng cách này. Ảnh hưởng của mỡ và dầu mạnh nhất trong môi trường nóng ẩm chính vì những chất này ngăn cản hơi ẩm tiếp xúc với vi trùng. Độ pH cũng cực kì quan trọng. Sự chịu nhiệt của bào tử vi khuẩn cao nhất ở pH trung tính và hạ khi tăng độ axít hoặc độ kiềm.

Tiệt trùng nóng khô

Điều kiện nóng khô diệt trừ vi trùng bằng quá trình oxi hóa. Quá trình nhiệt khô là phương pháp tối ưu để tiệt trùng đồ thủy tinh khô như ống nghiệm, đĩa Petri thủy tinh, bình tam giác, pipet, toàn bộ những ống tiêm thủy tinh và vật dụng như kẹp, dao mổ và kéo.

 Đồ thủy tinh cần phải được gói lại sao cho hơi nóng đi vào được mọi chỗ cần sấy. Quá trình này được hỗ trợ bằng hệ thống quạt trong tủ sấy. Thông thường thời gian cần cho tiệt trùng là 160°C trong 1 giờ. Tuy vậy đa số những tủ sấy, nhất là khi để nhiều, cần 2 đến 3 giờ mới đạt nhiệt độ. Như vậy 4 giờ ở 160°C là ít nhất cho một lô vật dụng lớn. Bốn tiếng đồng hồ ở 170°C là ranh giới an toàn.

 Không được mở tủ sấy trong khoảng thời gian sấy chính vì mở cửa trong vài giây có thể khiến nhiệt độ hạ tới 70°C, mà phải cần cả giờ tiếp đến để tủ sấy trở lại nhiệt độ có nhu cầu. Điều này sẽ khiến cho lô vật dụng đó không được tiệt trùng.

Tiệt trùng nóng ẩm

Nóng ẩm diệt trừ vi sinh vật, có thể qua việc làm đông và làm biến tính enzym và protêin cấu trúc của chúng, một quá trình cần có nước. Do đó toàn bộ những môi trường nuôi cấy được tiệt trùng nóng ẩm bằng phương pháp sử dụng nồi hấp.

 

Hấp ở nhiệt độ trên 100°C là biện pháp đáng tin nhất và được dùng rộng rãi nhất trong việc tiệt trùng những môi trường nuôi cấy. Đa số những nồi hấp và nồi áp suất hoạt động ở 121°C, ở nhiệt độ này thời gian ít nhất cho việc tiệt trùng là 15 phút. Việc đặc biệt là toàn bộ không khí phải thoát ra khỏi nồi hấp, nếu như không nồi hấp sẽ không đạt được đúng nhiệt độ. Nhiều nồi hấp lớn thực thi điều này 1 cách tự động. Nếu sử dụng nồi áp suất hoặc nồi hấp không tự động, để hơi nước xì ra ở van thoát hơi khoảng 2-3 phút trước khi đóng van hoặc vặn nắp. Phải sử dụng rổ thay vì hộp và không được hấp pipet trong hộp đựng chính vì những túi không khí phía bên trong khiến việc tiệt trùng mất hiệu lực. Nhiệt độ chứ KHÔNG PHẢI áp suất là tiêu chí thật sự quyết định sự thành công của quá trình tiệt trùng. Nồi hấp phải được chỉnh sao cho áp suất không hạ quá nhanh chính vì sẽ dẫn tới hiện tượng môi trường sôi tràn và làm ướt nắp đậy. Môi trường cần để yên trong nồi khoảng 5 phút sau khi nồi trở lại áp suất không khí, chính vì thỉnh thoảng những dung dịch còn ở phía trong hiện trạng nóng quá và có thể bắn môi trường hoặc agar đang sôi lên người, gây nên bỏng. Nếu để trong nồi hấp quá lâu, sẽ mất bớt thể tích do chân không tích tụ trong nồi hấp.

Đừng nên hấp các bình có chứa môi trường lớn nhỏ khác nhau cùng một mẻ chính vì những lượng lớn cần nhiều thời gian hơn để đạt được nhiệt độ cấp thiết, như thế sẽ khiến cho những lượng nhỏ nhận quá nhiều nhiệt. Bảng A3/3 đưa ra chỉ dẫn về thời gian cần thêm để đạt nhiệt độ có nhu cầu:

Bảng A3/3/ Thông thường thời gian khuyến nghị để tiệt trùng những lượng dung dịch khác nhau

Thể tích dung dịch	Thời gian thêm (phút)	Tổng cộng thời gian ở 121°C
chai 100 mililít	10	25
chai 250 mililít	12	27
chai 500 mililít	18	33
chai 1000 mililít	22	37
chai 2000 mililít	27	42

Tiệt trùng vật dụng

Kẹp, que cấy và những vật dụng khác phải được tiệt trùng trước khi tiếp xúc với mẫu cấy nhằm né lẫn tạp. Que cấy được tiệt trùng tối ưu nhất bằng phương pháp hơ cho nóng đỏ trên ngọn lửa.

 Phải để que cho nguội xuống nhiệt độ phòng trước khi sử dụng. Que cấy nóng là nguyên do phổ biến khiến cho việc cấy truyền, cấy đỉnh sợi nấm và cấy đơn bào tử bị thất bại.

Kẹp và dao được tiệt trùng bằng phương pháp nhúng vào cồn. Trước khi sử dụng, đốt sạch cồn bằng phương pháp hơ qua ngọn lửa để cồn bốc cháy. Đừng giữ vật dụng trên ngọn lửa vì sẽ khiến cho vật dụng nóng quá. Cẩn trọng không đặt những vật dụng nóng hoặc hơ lửa dung cụ trong hoặc gần cồn vì có thể gây hỏa hoạn.

Tiệt trùng bề mặt nơi làm việc

Khay, bàn và những bề mặt khác có thể được tiệt trùng với dung dịch tiệt trùng. Cồn là dung dịch thường hay được sử dụng nhất. Cồn pha nước là chất tiệt trùng tối ưu nhất, phù hợp nhất là cồn 70%. Cồn mêthyl cũng có thể dùng để tiệt trùng.

A3/6/ Bảo quản mẫu cấy

Bảo quản mẫu vi sinh vật sống

Mẫu vi sinh vật sống được lưu giữ sử dụng làm mẫu tham khảo, hoặc để sau này sử dụng trong suốt quá trình truyền bệnh nhân tạo hoặc những thí nghiệm khác. Những mẫu vi sinh vật lưu trữ trong bộ sưu tập mẫu vi sinh vật quốc gia là một phần những nguyên vật liệu tham khảo để hỗ trợ cơ sở dữ liệu quốc gia về nguyên nhân tạo bệnh cây.

Bảo quản trong nước cất—Pythium và Phytophthora

Đây chính là một biện pháp giản đơn và ít tốn kém đặc biệt phù hợp cho Pythium và Phytophthora. Nên dùng tủ cấy vô trùng để thực thi quy trình giữ mẫu này. Cắt những mẩu thạch vuông 1 centimét từ viền của một tản nấm mọc mạnh và còn mới. Đặt các miếng thạch chứa nấm này vào trong một lọ McCartney chứa nước vô trùng và vặn chặt nắp. Lọ bảo quản được để nơi mát. Không bảo quản trong tủ lạnh chính vì một vài loài bị chết ở nhiệt độ thấp. Những mẫu có thể được cất giữ từ 6 tháng đến 2 năm, dựa theo loài. Những mẫu được khôi phục bằng phương pháp lấy một miếng thạch từ lọ và cấy lên môi trường mới sao cho mặt có nấm tiếp xúc với bề mặt môi trường. Cần bảo đảm là nước và những miếng thạch không bị tạp vi khuẩn— sự hiện diện của vi khuẩn sẽ khiến cho nấm chết mau chóng.

Bảo quản hạch nấm

Hạch nấm có thể được lưu giữ trong một thời gian dài ở môi trường khô mát trong một lọ thủy tinh nhỏ có nắp vặn. Đây chính là kỹ thuật phù hợp để lưu giữ những loài như Sclerotium rolfsii, Sclerotinia sclerotiorum, Rhizoctonia spp. (những loài tạo hạch nấm).

Tại những khu vực nhiệt đới thì hoàn hảo nhất là nên lưu giữ hạch nấm trên giấy thấm khử trùng đặt phía trên silica gel màu xanh trong lọ McCartney (hoặc lọ có nắp vặn tương đương ) để có thể bảo đảm độ ẩm thấp trong suốt quá trình bảo quản.

Bảo quản những mẩu thân hoặc lá bị nhiễm bệnh.

Những mẫu vi sinh vật được nuôi cấy trên WA khử trùng chứa những mẩu mô cây hoặc hạt khử trùng. Những mẩu mô thực vật chứa vi sinh vật được làm khô rồi cất giữ trong những ống thủy tinh nhỏ. 1 cách khác, những mẫu này có thể được bảo quản trong lọ kín trên giấy thấm vô trùng đặt phía trên lớp silica gel màu xanh để có thể bảo đảm điều kiện bảo quản luôn khô.

Để có thông tin sâu rộng hơn về sự việc bảo quản những mẫu vi sinh vật, tham khảo Shivas and Beasley (2005), Quản lý mẫu bệnh thực vật.

Làm đông khô

Làm đông khô là biện pháp lựa chọn cho quá trình bảo quản lâu dài nhiều loại nấm và thường hay được sử dụng ở đa số những nơi quan trọng lưu giữ mẫu vi sinh vật. Điều trở ngại chính là cần có những thiết bị chuyên môn tốn kém. Biện pháp này phù hợp nhất cho các loài nấm mọc và sinh bào tử tốt trên mô cây khử trùng như những mẩu thân lúa xanh hoặc mẩu lá cẩm chướng. Cũng có rất đa số loài nấm không thể bảo quản bằng cách đông khô, như nấm trứng, gỉ sắt và sương mai.

Những mẫu nuôi cấy được làm đông khô bằng phương pháp làm khô những miếng lá hoặc thân chứa mẫu vi sinh vật trong những ống thuỷ tinh nhỏ trong hoàn cảnh chân không cao (10-1 đến 10-2 Torr). Những ống thủy tinh được nút bằng một miếng bông gòn nhỏ và hấp trong một cốc đong đậy nắp sơ. Lấy năm mẩu lá hoặc thân từ mẫu nuôi cấy (sau hai tuần nuôi cấy từ đơn bào tử), và sử dụng vật dụng vô trùng chuyển sang ống thủy tinh. Ống được đóng lại sau khi đã cho nhãn vào trong lọ, tiếp đến sử dụng đèn hàn hơ lửa và nối dài ống ra thành hình dáng như đồng hồ cát. Ống được gắn vào máy đông khô và vận hành máy trong 12-24 giờ, rồi hàn kín dưới điều kiện chân không cao và bảo quản ở nhiệt độ thường hoặc ở 5°C. Đa số loài nbsp;Fusarium và những chi nấm khác đã được làm đông khô thành công với kỹ thuật này và được bảo quản trong nhiều năm.

Những mẫu vi sinh vật này có thể được khôi phục bằng phương pháp cấy những mẩu lá hoặc thân đã làm đông khô lên một môi trường phù hợp. Ống thủy tinh có chứa mẫu bảo quản phải được tiệt trùng bề mặt trước khi đập vỡ để lấy những mẩu lá.

Những cách thức bảo quản mẫu vi sinh vật sống khác

Để bảo quản được lâu, những mẫu vi sinh vật cũng có thể được lưu giữ dưới dạng dung dịch bào tử trong glycerol ở -80°C. Đa số loài cũng có thể được lưu giữ thành công trong nitơ lỏng. Tuy vậy, các biện pháp này cực kỳ tốn kém.

Bảo quản mẫu nấm cho mục đích duy trì dữ liệu tiêu bản mẫu

Những mẫu gốc nuôi cấy trên môi trường PDA phải được nộp đến một trung tâm lưu giữ tiêu bản mẫu được thế giới được biết đến khi việc miêu tả chính thức một loài mới được công bố.

Những mẫu được nuôi cấy từ đơn bào tử nảy mầm và phát triển trong hoàn cảnh nhiệt độ và ánh sáng bình thường từ 2 đến 3 tuần. Mẫu nuôi cấy tiếp đến được tiến hành xử lý chết bằng phương pháp để đĩa tiếp xúc với dung dịch formalin trong một hộp kín trong 3 ngày. Mẫu tiếp đến được bảo quản bằng phương pháp sử dụng agar và glycerine. Ba gram agar hòa tan trong 147 mililít nước, tiếp đến được chia làm các phần 6 mililít bỏ trong ống nghiệm trước khi hấp. Lật ngược nắp đĩa mẫu nuôi cấy, cho 1,5-1,75 mililít glycerine và 6 mililít thạch nóng lên phía trên glycerine. Sử dụng vật dụng vô trùng nhấc mẫu nuôi cấy từ đĩa Petri lên và đặt lên phía trên hỗn hợp ở nắp đĩa. Những mẫu nuôi cấy tiếp đến được để cho khô trong ngăn kéo 3-5 ngày, che bằng một mảnh giấy. Khi khô, mẫu dẻo như cao su và có thể kéo ra khỏi đĩa Petri để lưu trữ. Quy trình này giai đoạn đầu được phát triển để bảo quản những loài Fusarium ở Trung tâm Nghiên cứu Fusarium, Đại học Bang Pennsylvania. Quy trình này cũng thích hợp với rất nhiều loại nấm.

Bảo quản nấm trong dầu khoáng

Nhiều mẫu nấm có thể được bảo quản trong dầu khoáng (paraffin) tới 4-5 năm ở 15-20°C. Những mẫu nên được nuôi cấy trên môi trường PDA có thêm 0,1% yeast extract (như Vegemite®). Dầu khoáng được chuẩn bị như sau:

1/ Đổ 11 mililít dầu paraffin vào chai McCartney 25 mililít không có nắp cao su.

2/ Đậy nắp lỏng và hấp tiệt trùng ở 121°C trong 20 phút.

3/ Để cho hoàn toàn nguội trong nồi hấp.

4/ Lấy nước khỏi dầu nếu có, bằng phương pháp làm nóng trong tủ sấy ở 120°C trong 8 giờ và để nguội dần trong tủ sấy qua đêm xuống nhiệt độ thường. Loại bỏ bất kể lọ nào có dầu vẩn đục hoặc thực thi lại quá trình làm nóng trong tủ sấy.

Những mẫu nấm cần phải được nuôi cấy phía trên mặt nghiêng môi trường PDA có thêm yeast extract trong lọ McCartney 25 mililít (không có nắp cao su) cho đến lúc nấm mọc bao trùm tất cả bề mặt môi trường. Để bảo quản mẫu nuôi cấy, sử dụng vật dụng vô trùng thêm 11 mililít dầu thô đã tiệt trùng vào mỗi mẫu trong trong tủ cấy vô trùng. Ghi nhãn cẩn trọng với số mẫu và ngày cất giữ

Những mẫu vi sinh vật có thể được cấy lại như sau:

1/ Sử dụng vật dụng khử trùng lấy một miếng thạch nhỏ từ mẫu bảo quản..

2/ Thấm dầu với giấy lọc hoặc giấy thấm khử trùng.

3/ Cấy mẩu thạch lên một môi trường phù hợp.

Ghi chú: Mỗi lần nên bảo quản ba mẫu từ mỗi nguồn nấm, và mẫu bảo quản trong dầu thô cần phải được thay thế sau 4-5 năm.

---

Những tác giả chân thành cảm ơn N.J. Cother và M.J. Priest qua các đóng góp về mặt kỹ thuật này của họ.

---

Tài liệu tham khảo

Andrews S. and Pitt J.I. 1986/ Selective medium for isolation of Fusarium species and dematiaceous hyphomycetes from cereals. Applied Environmental Microbiology 51(6), 1235-1238/

Fisher N.L., Burgess L.W., Toussoun T.A. and Nelson P.E. 1982/ Carnation leaves used as a substrate and for the preservation of cultures of Fusarium species. Phytopathology 72, 151-153/

Kelman A. 1954/ The relationship of pathogenicity in Pseudomonas solanacearum lớn colony appearance on tetrazolium medium. Phytopathology 44, 693-694/

Nash S.M. and Snyder W.C. 1962/ Quantitative estimations by plate counts of propagules of the bean root rot Fusarium in field soils. Phytopathology 52, 567-572/

Nirenberg H.I. 1976/ Untersuchungen uber die morphologische und biologische differenzierung der Fusarium section liseola. Mitt Biol Bundesanst Land. Forstw Berlin-Dahlem.

Shivas R. and Beasley D. 2005/ Management of plant pathogen collections. Australian Government Department of Agriculture, Fisheries and Forestry. At: <http://www.daff.gov.au/planthealth>.

• Phần 1: Phần giới thiệu
• Phần 2: Tổng quát về sức khỏe thực vật và những nhân tố tác động
• Phần 3: Quy trình chẩn đoán nguyên nhân tạo bệnh trong khu vực phòng thí nghiệm và ngoài ruộng đồng
• Phần 4: Những dấu hiệu bệnh cây
• Phần 5: Quy trình và thiết bị làm việc trên ruộng đồng
• Phần 6: Quy trình và thiết bị làm việc trong khu vực phòng thí nghiệm
• Phần 7: Giới thiệu sơ lược về phân loại nấm
• Phần 8: Những biện pháp truyền bệnh nhân tạo
• Phần 9: Quản lý bệnh gây hại tổng hợp
• Phần 10: Những bệnh do nấm có xuất xứ từ đất
• Phần 11: Những bệnh thông thường gặp trên một vài cây trồng có ý nghĩa kinh tế
• Phần 12: Tác động sức khỏe từ nấm tạo bệnh
• Phần 13: Thiết kế, xây dựng và vận hành những phòng thí nghiệm và nhà lưới sử dụng cho chẩn đoán
• Phần 14: Phụ lục về kỹ thuật làm que cấy dẹp, sức khỏe an toàn trong công việc, cũng như những công thức nấu môi trường, những biện pháp tiệt trùng, và những biện pháp lưu giữ mẫu nấm.