Cẩm nang chẩn đoán bệnh cây – P3: Quy trình chuẩn đoán

P1 | P2 | P3 | P4 | P5 | P6 | P7 | P8 | P9 | P10 | P11 | P12 | P13 | P14

Những bước chính trong quy trình chẩn đoán bệnh gây hại cây trồng là:

• Thu thập mẫu bệnh ngoài ruộng đồng

• Kiểm tra những mẫu bệnh thu thập được trong khu vực phòng thí nghiệm

• Truyền bệnh nhân tạo

• Chẩn đoán bệnh.

Những đoạn này được minh họa trong hình dưới

Nghiên cứu cụ thể quy trình chuẩn đoán bệnh gây hại cây trồng

Trong phần này, hai nghiên cứu cụ thể được trình bày để minh họa cho quy trình chẩn đoán:

• Chẩn đoán nguyên do tạo bệnh thối nõn dứa – Phytophthora nicotianae

• Điều tra một phức hợp bệnh – héo trên gừng do vi khuẩn và nấm Fusarium.

Sơ đồ quy trình chuẩn đoán bệnh gây hại cây trồng

• Nghiên cứu cụ thể chẩn đoán 1

Chẩn đoán nguyên do tạo bệnh thối nõn dứa – Phytophthora nicotianae

Minh họa một ví dụ về những bước trong quy trình chẩn đoán.

Những bước phân lập, làm thuần và truyền bệnh nhân tạo nấm gây thối nõn dứa, Phytophthora nicotianae (Ảnh do Đặng Lưu Hoa cung ứng )

• Nghiên cứu cụ thể chẩn đoán 2

Điều tra một phức hợp bệnh – héo trên gừng do vi khuẩn và nấm Fusarium

Giới thiệu

Bệnh héo trên gừng được ghi nhận lần đầu tại Quảng Nam vào năm 2000. Bệnh làm ra tổn thất rất nghiêm trọng, nhiều nông dân thất thu 100%. Một nghiên cứu sơ bộ năm 2006 cho biết bệnh héo có nguyên do do cả vi khuẩn và nấm Fusarium. Một cuộc điều tra hệ thống về phức hợp bệnh này đã được tiến hành xử lý vào tháng 1 năm 2007, một phần bên trong dự án CP/2002/115 “Chẩn đoán, khuyến nông và ngăn ngừa, diệt trừ bệnh gây hại cây trồng tại những tỉnh trung bộ Việt Nam” (2005-2008) của Trung tâm Nghiên cứu Nông nghiệp Quốc tế Australia.

Mục tiêu của nghiên cứu là loại phân lập, tìm ra những nguyên nhân có liên quan đến bệnh và xác định sự quan trọng của chúng đối với bệnh. Mười cây bị hại đã được thu thập từ 10 ruộng khác nhau thuộc hai huyện Phú Ninh và Tiên Phước, hai vùng trồng gừng chính tại Quảng Nam. Những ruộng được chọn lựa ngẫu nhiên để lấy mẫu trước khi mẫu được kiểm tra chi tiết.

Trên ruộng

Thông tin được thu thập từ nông dân tại mỗi ruộng trồng. Những nông dân xác nhận là có hai dạng héo: héo nhanh và héo chậm. Lá cây bị héo nhanh có dấu hiệu giống như ‘luộc trong nước sôi’. Trái lại, lá các cây bị héo chậm có tình trạng biến vàng. Các đánh giá này chỉ ra rằng có hai bệnh liên quan và những dấu hiệu héo đã miêu tả được giả thiết là héo vi khuẩn (héo nhanh) và héo Fusarium (héo chậm).

Thảo luận với nông dân về bệnh héo trên gừng

Điều tra bệnh héo gừng ở Quảng Nam vào tháng 1 năm 2007: (a) gừng với dấu hiệu héo nhanh, (b) cây gừng bị vàng, biểu hiện của héo chậm, (c) những ruộng gần nhau, một ruộng bị héo nhanh, một ruộng không có dấu hiệu héo, (d) và (e) những mẫu cây được đào lên 1 cách cẩn trọng bằng dao rựa, giữ cho hệ thống rễ còn nguyên, (f) túi mẫu với nhãn đánh số điểm lấy mẫu, tên nông dân và ngày lấy mẫu

Trong khu vực phòng thí nghiệm

Chuẩn bị mẫu cấy

Rễ cây được rửa cẩn trọng để tiến hành loại bỏ đất bẩn. Tiếp đến kiểm tra mẫu cây và lấy những mẫu nhỏ lấy từ các phần bị nhiễm bệnh trên cây đem vào phòng thí nghiệm để kiểm tra dưới kính hiển vi và phân lập nguyên nhân tạo bệnh (Hình dưới).

Nhẹ nhàng rửa đất khỏi rễ – Kiểm tra cây (lá, mầm, củ, rễ) và ghi lại dấu hiệu

Tuyến trùng nốt sưng (Meloidogyne sp.) có trong một vài mẫu rễ – Cắt củ ra khỏi rễ và thân

Hình trên: Chuẩn bị và kiểm tra những mẫu cây bị hại héo gừng để lựa chọn mẫu cho phòng thí nghiệm

Phân lập những vi sinh vật có thể tạo bệnh từ mô bệnh

Những củ gừng được tiệt trùng bề mặt, gọt vỏ và tiệt trùng bề mặt lần nữa. Từ mỗi củ cắt ra một lát, tiếp đến những miếng cấy nhỏ lại được cắt ra từ lát cắt trên và cấy lên môi trường peptone PCNB (pentachloronitrobenzene) và môi trường lựa chọn cho Phytophthora. Lấy một miếng cấy nhỏ, dằm nát và sử dụng que cấy khuẩn cấy lên môi trường King’s B để phân lập vi khuẩn.

Củ được tiệt trùng bề mặt trong cồn êtylic 70% trong 5 giây và hơ qua lửa đèn cồn

Củ được gọt vỏ (bỏ lớp bên ngoài ) tiếp đến tiệt trùng bề mặt lần nữa trong cồn êtylic 70%

Củ đã gọt vỏ được hơ qua lửa đèn cồn và một lát cắt được cắt ra ở phần củ giáp với thân lá, toàn bộ vật dụng đều được tiệt trùng

Năm miếng cấy nhỏ được cắt ra từ lát cắt, cấy hai miếng lên môi trường PPA và hai miếng lên môi trường PSM

Miếng cấy còn lại được dằm nát trong nước vô trùng trên một lam kính và sử dụng que cấy khuẩn cấy lên môi trường King’s B để phân lập vi khuẩn

Hình trên: Quy trình phân lập những vi sinh vật có thể tạo bệnh từ củ gừng

Kết quả phân lập những nguyên nhân có thể tạo bệnh

Fusarium spp. đã được phân lập từ củ (Hình trên) của các cây có dấu hiệu héo chậm – vàng lá và có tuyến trùng nốt sưng – ở các điểm điều tra. Các mẫu nấm phân lập được làm thuần bằng phương pháp cấy đơn bào tử và được giám định là Fusarium oxysporum.

Những mẫu nấm F. oxysporum có hình thức biểu hiện ra bên ngoài giống hệt nhau trên môi trường thạch lá cẩm chướng và môi trường thạch đường dextrose khoai tây, cho thấy rằng chúng có thể là nấm tạo bệnh. (Những mẫu cấy của F. oxysporum hoại sinh thường có hình thức biểu hiện ra bên ngoài không đồng nhất.)

Phân lập Fusarium oxysporum từ miếng cấy gừng trên môi trường lựa chọn (aga peptone pentachloronitrobenzene) cho Fusarium

Không phân lập được Phytophthora từ củ gừng.

Chẩn đoán nhanh Ralstonia solanacearum sử dụng Bộ Kít Pocket Diagnostic® cho kết quả dương tính đối với củ lấy từ ba cây có dấu hiệu héo nhanh, chứng minh là vi khuẩn này có trong mô củ. Sử dụng Kít thử tương đương cho kết quả âm tính đối với củ từ một cây có dấu hiệu héo chậm (héo vàng) – F. oxysporum đã được phân lập từ củ này.

Nhiều khuẩn lạc khác nhau đã được phân lập từ môi trường King’s B và không thể xác định 1 cách chuẩn xác khuẩn lạc thuần R. solanacearum. Chính vì những cây được lấy làm mẫu có các dấu hiệu từ hiển nhiên đến cực kỳ nặng và đã phải chịu hiện trạng đất cực kỳ ướt trước khi lấy mẫu, đây chính là điều kiện thuận lợi cho sự thâm nhập của những vi khuẩn không tạo bệnh vào mô cây đã bị nhiễm bệnh.

Vì nguyên do trên, một thí nghiệm chỉ thị sinh học đã được triển khai để tìm cách phân lập được vi khuẩn R. solanacearum. Mô phía bên trong của những củ lấy thêm từ các mẫu cây thu thập tại sáu ruộng trước đó đã cắt thành từng miếng nhỏ và lắc kỹ với 30 mililít nước vô trùng. Tiếp đến dung dịch này được đổ vào các lọ nhỏ và cắm vào đó những cây giống cà chua và ớt vừa mới được cắt bỏ phần rễ và gốc thân (ớt và cà chua được sử dụng như cây chỉ thị để bẫy vi khuẩn). Những lọ nhỏ này được đặt trong nhà kính ở 25-30°C. Trong vòng 4-8 ngày, một vài ngọn ớt và cà chua thể hiện triệu chứng héo đi và thử thấy dịch khuẩn ứa ra. Các cây giống đối chứng được cắm vào nước vô trùng vẫn khỏe bình thường.

Thí nghiệm chỉ thị sinh học để phân lập Ralstonia solanacearum từ củ gừng bị nhiễm bệnh: (a) ngọn cây chỉ thị ở công thức đối chứng (trái) ngọn cây chỉ thị héo trong nước chiết từ những miếng gừng (phải), (b) ngọn ớt bị héo có dấu hiệu hóa nâu ở mạch dẫn, (c) phân lập R. solanacearum từ ngọn ớt, (d) và (e) truyền bệnh nhân tạo trên mướp đắng với vi khuẩn đã được phân lập từ cây chỉ thị.

Một đoạn thân của mỗi cây chỉ thị bị héo được dầm nát trong nước vô trùng và sử dụng que cấy khuẩn cấy lên môi trường King’s B. Tiếp đến, một khuẩn lạc từ môi trường này được cấy truyền để làm thuần và tiêm vào thân cây mướp đắng 6-tuần tuổi để nhận xét khả năng tạo bệnh. Một vài cây mướp đắng thể hiện triệu chứng héo rũ và quá trình phân lập được lặp lại với các cây này để lấy mẫu vi khuẩn R. solanacearum thuần gửi đi giám định tại một trung tâm tiêu chuẩn quốc tế.

Truyền bệnh nhân tạo để xác định nguyên do chính tạo bệnh

Fusarium oxysporum f. sp. zingiberi đã được ghi nhận rộng rãi tại nhiều nước là nguyên tạo bệnh héo Fusarium ở gừng. Tuy vậy, các mẫu nấm F. oxysporum phân lập được từ gừng ở Quảng Nam cần phải được truyền bệnh nhân tạo trên những giống gừng ở địa phương để chứng tỏ rằng đó là nấm tạo bệnh chứ không phải nấm hoại sinh. Do đó, các mẫu Fusarium đại diện được cấy lên giá thể hạt kê/trấu để sử dụng cho việc truyền bệnh nhân tạo.

Chính vì nbsp;R. solanacearum cũng được biết tới là nguyên do gây nên bệnh héo vi khuẩn trên gừng, những mẫu R. solanacearum cũng được sử dụng truyền bệnh nhân tạo trên những giống gừng địa phương để hoàn tất nguyên tắc Koch (tiêu chí sử dụng để thiết lập mối liên lạc nhân quả giữa nguyên nhân tạo bệnh và bệnh).

Để giám định chuẩn xác nguyên nhân tạo bệnh, những mẫu vi khuẩn R. solanacearum thuần cũng được gửi đi giám định tại một phòng thí nghiệm tiêu chuẩn quốc tế. Loài vi khuẩn này cực kỳ đa dạng, bao gồm nhiều chủng khác nhau gây bệnh trên những ký chủ khác nhau và yêu cầu ứng dụng những giải pháp luân canh cây trồng khác nhau để ngăn ngừa, diệt trừ bệnh.

Những mẫu tuyến trùng nốt sưng Meloidogyne cũng được gửi tới một phòng thí nghiệm tiêu chuẩn để giám định loài 1 cách chuẩn xác.

Sau khi truyền bệnh nhân hình thành công

Khi đã cam kết được những vi sinh vật gây héo là nguyên do tạo bệnh trên gừng, những cán bộ đã lựa tìm nguồn gừng sạch bệnh trồng trên các ô trình diễn nhỏ nơi đất không có nguồn gây bệnh. Đất được coi là không có nguồn gây bệnh nếu những vụ cây trồng trước đó không có héo vi khuẩn (và tuyến trùng nốt sưng). Chú ý rằng R. solanacearum có phổ ký chủ rất rộng lớn.

Cho dù nbsp;F. oxysporum f. sp. zingiberi chỉ gây nên bệnh trên gừng, nó có khả năng tồn tại ở rễ của các cây không phải là ký chủ và không thể hiện triệu chứng. Dọn dẹp vệ sinh tốt cho cây trồng là cực kỳ cấp thiết sao cho đất từ các ruộng có bệnh không được đưa vào ruộng sạch bệnh qua giầy dép và những vật dụng làm ruộng.

Cuốn cẩm nang này được sắp xếp thành những phần sau:

• Phần 1: Phần giới thiệu
• Phần 2: Tổng quát về sức khỏe thực vật và những nhân tố tác động
• Phần 3: Quy trình chẩn đoán nguyên nhân tạo bệnh trong khu vực phòng thí nghiệm và ngoài ruộng đồng
• Phần 4: Những dấu hiệu bệnh cây
• Phần 5: Quy trình và thiết bị làm việc trên ruộng đồng
• Phần 6: Quy trình và thiết bị làm việc trong khu vực phòng thí nghiệm
• Phần 7: Giới thiệu sơ lược về phân loại nấm
• Phần 8: Những biện pháp truyền bệnh nhân tạo
• Phần 9: Quản lý bệnh gây hại tổng hợp
• Phần 10: Những bệnh do nấm có xuất xứ từ đất
• Phần 11: Những bệnh thông thường gặp trên một vài cây trồng có ý nghĩa kinh tế
• Phần 12: Tác động sức khỏe từ nấm tạo bệnh
• Phần 13: Thiết kế, xây dựng và vận hành những phòng thí nghiệm và nhà lưới sử dụng cho chẩn đoán
• Phần 14: Phụ lục về kỹ thuật làm que cấy dẹp, sức khỏe an toàn trong công việc, cũng như những công thức nấu môi trường, những biện pháp tiệt trùng, và những biện pháp lưu giữ mẫu nấm.